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【阿斯利康案例】使用SpinChem RBR旋转床反应器进行固定化酶促反应 2019-10-25

【阿斯利康案例】使用SpinChem RBR旋转床反应器进行固定化酶促反应


背景介绍

酶作为生物催化剂在医药、精细化工、香料、维生素、食品和纺织工业中被广泛使用。过去几十年中,生物催化剂因其环境友好、安全、良好的化学、区域和立体选择性而得到广泛应用。不过,酶的工业应用仍面临着严峻的挑战。在工业规模上,酶所要面对的一些问题主要在于长期操作的稳定性、活性、反应产物的抑制、对化学反应的选择性、回收率、可重复使用性、易操作性以及在成本上的一些考量。

为了克服这些问题,人们发展了多种技术,如酶固定化,即在不同载体上经过吸附、共价键合、亲和性、离子交换等方法将酶固定化,可大大增强过程控制和稳定性,优化存储和操作条件,并大大简化了回收过程,从而降低了操作成本。

在实际生产过程中,为了简化固定化酶回收过程,提高生产效率,节约生产成本,反应条件的优化和反应器的改进必不可少。工业上广泛使用的是搅拌槽反应器,由于搅拌桨的搅拌作用,经常遇到固定化酶的机械磨损的问题。这种机械磨损效应会导致其固定化骨架磨损,形成难以去除的粉状颗粒,并在回收时导致酶的损失。在这种情况下,问题就会变得比较复杂,并影响工业规模上反应的再现性。

为了避免机械应力作用,瑞典SpinChem公司开发了一种新型的旋转床反应器,它结合了流化床反应器和搅拌槽反应器的优点。如图1,它由机械搅拌轴和四室旋转流动池催化剂室组成,使用时将固定化酶装填到催化剂室即可。由于离心力的作用,反应物反复通过固定化酶,保证了填充床传质的有效性,既保证了酶免受剪切力和研磨的破坏,也确保了酶载体的稳定性,简单沥水就可以快速回收酶无需过滤,大大简化了回收过程,提高了回收效率。

图1 SpinChem旋转床反应器


SpinChem旋转床反应器被广泛应用,例如,在固定化转氨酶催化的反应中,Bornscheuer等人证明了旋转床反应器技术的应用使酶的重复利用更加方便。脂肪酶催化的分子内胺化反应也有报道。近日,阿斯利康的Subhash Pithani等人使用SpinChem的技术,比较和验证了旋转床反应器在药物构建块和原料药工艺开发和制造中的应用。作为本研究的模型反应,选择了最近发表的诺维信435催化的(顺式)-异丙基3-氨基环己酸酯的乙酰化反应(图2所示),该反应在普通釜式反应下以高产率和对映选择性合成酰胺2。用旋转床反应器技术代替原有工艺,考察了搅拌速度、温度以及酶的易回收性对反应的影响。并使用最佳条件来评估了反应的放大能力。

图2 诺维信435催化的乙酰化反应

实验条件优化

本文利用SpinChem旋转床反应器对图2中的反应条件进行了优化。首先根据转化率和对映体选择性及反应速率对20种固定化酶进行了筛选,最终选择诺维信435固定化脂肪酶,其实现预设的50%转化率所需时间为6 h,对映体选择性为90% ee。在SpinChem旋转床床反应器RBR S2中对其装载效应进行了考察,反应条件20oC,500 rpm,酶载量10% wt/wt条件下,反应速率最快(6 h实现50%的转化率)。兼顾反应速率和涡流技术实现的便利性,选择500 rpm为最佳搅拌速率。在不影响对映选择性的情况下,随着反应温度的升高,转化率达到45-50%的时间明显缩短,选择50oC作为下一步循环实验的最佳温度。


回收实验:

在优化的反应条件下,通过循环实验对固定化酶的重复使用性进行了评价。通过在线FT-IR连续监测(图3),在50oC的反应温度、10%的诺维信435负载和500 rpm的搅拌速率下,使用同一批次的酶执行10个循环。每次循环实验结束后,简单地排出反应混合物,并在下一次循环实验之前向旋转床反应器中注入反应物。发现固定化酶在这些条件下非常稳定,可以连续进行10次循环实验反应,反应速率和酶的对映选择性(90% ee,图3和4)保持得都很好。值得一提的是,即使在10个周期后,诺维信435仍然具有很高的催化活性,并且保持与第一个周期后获得的一样好的对映选择性。

图3 在SpinChem RBR S2中使用诺维信435对乙酰化率及对映体选择进行循环实验,共10个循环



图4 FT-IR在线观察SpinChem旋转床反应器中目标反应的转化率


放大实验:

利用优化后的反应条件,对反应的可放大性进行了评价。从使用150mL SpinChem RBR旋转床反应器的小规模实验开始,进一步将反应放大到1L(SpinChem旋转床反应器RBR S3)和10 L(SpinChem旋转床反应器RBR S4)。令人满意的是,在所有三种规模下都观察到了一致的反应速率和对映选择性(图6)。

图5  (左)反应器设置与在线FT-IR监测和(右)SpinChem旋转床反应器RBRS4(10升)


在1000 g的规模(SpinChem旋转床反应器RBR S4 10L),酶负荷为10% wt/wt,底物负荷为100 g/L,反应成功进行放大。在50℃条件下,90 min内反应转化率达到46%,经过酸性水处理和结晶后,得到了总收率为39%,98.8% ee的目标化合物。

图6 反应放大的效果

结论

为使固定化酶用于医药和大宗化学品实际生产及实现经济价值,不仅需要酶保持高催化活性,还需要底物到活性位点之间有高效的传质速率。而且酶的固定化成本通常比较高,只有进一步延长酶的重复使用周期,才能降低生产成本及运营费用。

固定化酶的再利用程度取决于酶在工艺条件下的稳定性,载体的完整性和由于机械应力造成的磨损程度,检测及大规模回收的便利性。

本文用SpinChem RBR旋转床反应器技术证明了诺维信435固定化酶参与的1乙酰化反应的可行性,有效保证了对映选择性和反应速率。此外,同一批酶可重复使用多达10个循环,不仅催化活性损失非常小,而且无需过滤,即可快速回收固定化酶,本文还对其生产放大进行了研究,利用SpinChem旋转床反应器可以从100 mL实验室规模直接放大到10 L的中试及更大的生产规模,为实际规模化生产提供了可行性依据。

参考文献:

DOI: 10.1021/acs.oprd.9b00240

Using Spinchem? RBR Technology for Immobilized Enzymatic Reactions: A Case Study

Subhash Pithani, Staffan Karlsson, Hans Emten?s, and Christopher ?berg, Org. Process Res. Dev, Publication Date (Web): 24 Jul 2019


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深圳市一正科技有限公司,作为荷兰Chemtrix公司(微通道反应器)、英国AM公司(连续多级搅拌反应器、催化加氢系统)、瑞典SpinChem公司(旋转床反应器)在中国区的独家代理商和技术服务商,为广大高校和企业提供连续合成、在线萃取、连续结晶、在线过滤干燥、在线分析等整套连续工艺解决方案。


公司与复旦大学、南京大学、中山大学、华东理工大学、南京工业大学、浙江工业大学、河北工业大学等高校研究机构合作成立微通道连续流化学联合实验室,致力于推动连续流工艺在有机合成、精细化工、制药行业、能源材料、食品饮料等领域的应用,合作实验室可以为客户的传统间歇釜式工艺在连续流工艺上的转变提供工艺验证、连续流工艺开发工作,促进制药及精细化工企业由传统间歇工艺向绿色、安全、快速、经济的连续工艺转变。


公司与荷兰Chemtrix B.V.在浙江台州、江苏南京合作组建了连续流微通道工业化应用技术中心(以下简称“工业化技术中心”),旨在打造集连续流微通道工艺开发、中试试验、工业化验证、技术交流于一体的综合性连续流微通道应用技术服务中心,以为广大生物医药企业、化工类企业提供专业、完善的智能化连续流工艺整套系统解决方案及一流的技术服务方案。


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